Née dans une famille de professeurs de musique le 14 février 1959 à Indiana (Pennsylvanie), Renée Fleming pratique très tôt le chant à la maison et à l'église, ainsi que la danse, le piano et le violon. Installée dans l'Etat de New York depuis son enfance, elle étudie à la Julliard School et en Europe auprès d'Arleen Auger.
Chanteuse professionnelle depuis le milieu des années 1980, Renée Fleming interprète aussi bien des airs d'opéra que du jazz. En 1986, elle est remarquée à Salzbourg dans L'Enlèvement au sérail de Mozart. Elle triomphe ensuite au New York City Opera et à Covent Garden (Londres) dans La Bohème et dans Medée (Cherubini). En 1991, remplaçante au pied levé de Felicity Lott dans Les Noces de Figaro au Metropolitan Opera de New York, Renée Fleming gagne ses galons de diva. Elle reprend le rôle de la Comtesse à San Francisco, Vienne et Glyndebourne. Dès lors, les portes des plus grands opéras lui son ouvertes.
En 1993, la cantatrice américaine interprète La Flûte enchantée au Metropolitan Opera de New York et fait ses débuts à la Scala de Milan. Son répertoire ne cesse parallèlement de s'élargir entre Anton Dvorak (Russalka), Richard Strauss (Le Chevalier à la rose), Jules Massenet (Hérodiade) et Benjamin Britten (Peter Grimes). Après avoir signé un contrat d'exclusivité avec la firme Decca et reçu le prix Solti, Renée Fleming interprète le rôle d'Eva dans Les Maîtres Chanteurs de Nuremberg au festival de Bayreuth en 1996.
La cantatrice se produit souvent dans son pays. Elle crée notamment le rôle de Blanche DuBois dans l'opéra Un Tramway nommé Désir d'André Previn en 1998, effectue une longue tournée mondiale en 2000, puis en 2002, participe à la bande originale du film Le Seigneur des anneaux. Deux ans après, elle se produit sur scène avec Elton John. Sa discographie compte une trentaine de CD répartie entre les opéras et les récitals. Elle enregistre notamment les Quatre derniers lieder de Richard Strauss en 1995 et Strauss Heroines, les Lieder de Schubert, The Beautiful Voice avec Jeffrey Tate et I Want Magic avec James Levine, et plus récemment Homage: The Age of the Diva (direction Valery Gergiev). En 2010, elle fait une immersion dans le domaine pop/rock avec l'album Dark Hope et ses reprises insolites de Muse ou de Leonard Cohen.
Très populaire pour une chanteuse d'opéra, Renée Fleming est gâtée côté récompenses : nommée douze fois aux Grammy Awards, elle en remporte trois en 1996, 1999 et 2010 pour le CD Verismo. Honorée du Polar Prize en 2008 et de la Médaille des Arts remise par le président américain Barack Obama en juillet 2013, la cantatrice livre en octobre ses « plaisirs coupables » (Guilty Pleasures), sous la forme d'un récital comprenant chansons traditionnelles et airs d'opéra enregistrés avec le Philharmonia Orchestra dirigé par Sebastian Lang-Lessing. Sur le « Duo des fleurs » de Lakmé (Léo Delibes), elle invite sa consoeur Susan Graham. Elle participe également au spectacle de Billy Childs Map to the Treasure: Reimagining Laura Nyro, rendant hommage à la chanteuse disparue.
En 2014, Renée Fleming enregistre Christmas in New York, un recueil d'airs traditionnels liés à la thématique de Noël, auquel participe Chris Botti, Brad Mehldau, Gregory Porter, Rufus Wainwright, Kurt Elling, Wynton Marsalis et Kelli O'Hara. Entre deux rôles, elle s'associe ensuite à l'Emerson String Quartet pour un programme enregistré comprenant la Suite lyrique (1926) d'Alban Berg et les Sonnets (1934) d'Egon Wellesz. Le récital suivant, Distant Light (2017), dirigé par Sakari Oramo, comprend le cycle mélodique The Strands Settings d'Anders Hillborg aux côtés de mélodies de Samuel Barber et de la chanteuse islandaise Björk. La même année, elle interprète à nouveau le rôle de la Maréchale dans Le Chevalier à la rose de Richard Strauss au Metropolitan Opera de New York. Elle enchaîne avec une participation à la comédie musicale Carousel, jouée à Broadway, puis le récital Broadway (2018), comprenant quelques-uns des airs les plus célèbres du genre.
Membre de l'Académie royale de musique de Londres et docteur honoraire de la Juilliard School de New York depuis 2003, Renée Fleming a reçu le titre de Chevalier de la Légion d'honneur en France (2005) et le Polar Prize en Suède (2008).
